限制性内切酶在中国

01 中国的限制酶相关研究

由于历史原因，中国的现代分子生物学研究直到20世纪70年代才真正起步，落后国外近20年。欲先善其事，必先利其器，分子生物学研究需要众多工具酶和试剂。当时国外已有NEB、Fermentas等公司供应分子生物学试剂，但对于当时的中国科研人员来说价格非常昂贵，购买也很困难。于是大家只能自己动手，丰衣足食，在简陋艰苦的条件下，自行开始分离纯化限制酶的探索。

1978年，也就是Arber、Nathans和Smith因发现限制酶而获得诺贝尔生理学或医学奖的同年，我国核酸生化领域的奠基人、中科院上海生化所王德宝研究员（1980年当选为中科院学部委员）带领团队，从流感嗜血杆菌的三个不同菌株中分离纯化获得了三种限制酶，分别命名为HinP₁I、HinS₁I、HinS₂I。其中HinS₁I、HinS₂I是HhaI的同裂酶，而HinP₁I是HhaI的异裂酶。相关成果于1980年发表在《中国科学》上（图1），这是中国最早关于限制酶的研究报道，也是中国第一次自主鉴定获得限制酶。

图1 中国第一篇限制酶研究论文

短短两三年内，中科院上海生化所李载平团队（1996年当选为中国工程院院士）、中国医学科学院基础医学研究所梁植权团队（1980年当选为中科院学部委员）、中科院生物物理所陈受宜团队、中科院上海细胞所匡达人团队、中科院微生物研究所张静娟、武汉大学病毒学系、中山大学罗进贤、军事医学科学院基础医学研究所谷志远等，分别参照国外文献或自主改良方法，先后提取纯化了BglI、BglII、PstI、BamHI、EcoRI、HpaII、AluI、SalI等十几种常用的限制酶，纯度和性能均不亚于当时国外同类产品。这些先驱者的辛勤工作，为正在起步的中国分子生物学研究提供了宝贵而及时的工具。

值得一提的是，1982-1984年，时任中国医学科学院基础医学研究所助理研究员的强伯勤（1991年当选为中科院学部委员）赴NEB做访问学者。在此期间，他在NEB主持鉴定了首批八碱基高特异性限制酶SfiI和NotI（NotI目前仍是NEB销量最大的限制酶之一），还发现了NlaIII，NlaIV，NslI等一系列新的限制酶。

此后又有不少中国学者零星地从事限制酶鉴定、分离和纯化的研究，也鉴定出了少量国外未曾报道的限制酶，但均未形成商业化产品。仅有1994年复旦大学陈中孚等在NEB的资助下从脂肪嗜热芽孢杆菌GR75中分离获得限制酶BsrGI，并进入NEB产品目录。

在从天然细菌中分离纯化限制酶的基础上，2000年，中国协和医科大学刘金毅等报道了限制酶EcoRII的重组表达过程，产率和纯度均高于国外文献。这是国内首次重组表达限制酶。此后，又有一些科研院所和公司也陆续开展了限制酶重组表达、发酵、纯化的研究，并形成了一批论文和专利，但主要是满足自用需求，也未能形成体系化的产品。

除了限制酶的分离、表达、纯化外，也有少数中国学者对限制酶的功能、机制进行了一些研究。早在1982年，中科院上海生化所陈常庆研究员团队就对限制酶EcoRI的底物专一性进行了研究。20世纪八九十年代，武汉大学生物系邹国林老师对限制酶的活性、结合机制、反应动力学都进行了较为系统的研究。近年来，也有一些国内研究者对限制酶的结构进行了一些探索，但均未形成较大影响力。

图2 限制酶DraIII的N端和C端结构域相互作用

T181A突变破坏了T181和D55之间的氢键，大幅降低了DraIII的星号活性

与限制酶相关研究相比，在限制酶的商业化道路上，中国则走得更加坎坷。

1985年，真正意义上的中国分子生物学试剂先驱——中外合资的华美生物工程公司在河南洛阳成立。为什么会落在河南，坊间还有一段八卦。据说美国著名试剂商Promega某创始人的父亲曾于上世纪30年代在河南一带传教，有了一段情结。后来该创始人80年代初到河南替父还愿，与当地政府一拍即合，与洛阳肉联厂（即后来的春都集团）、中信兴业三家合资成立了华美生物。

华美生物成立仅三年，就能生产80余种生物试剂，其中12项填补国内空白，11项达到了80年代中期国际先进水平，1989年就能够向美国出口分子生物学产品，成为当时国内唯一的、专业化、高水平的工具酶供应基地。此后华美生物又进军体外诊断行业，陆续开发出甲肝、乙肝、丙肝、HIV等多种病毒的酶联免疫检测试剂盒，2003年还率先在国内研制出SARS病毒诊断试剂。20世纪90年代发表的不少中文论文里，都说限制酶购自华美生物；然而也有地方提到当时华美生物只能自产DNA聚合酶等分子试剂，限制酶产品是Promega进口分装。具体如何，因年代久远已不可考。

可惜进入21世纪后，由于股东变更和后续的一系列谜之操作，华美生物在2004年被提请破产。2009年被收购后，重新在洛阳成立华美生物工程有限公司，但伤筋动骨，早已不复当年之勇。无论如何，作为中国生物技术行业的“黄埔军校”，华美生物值得在中国生物技术发展史上留下浓重的一笔。

图4 当年的华美生物工程公司

在华美生物提请破产之后的十余年间，DNA聚合酶、连接酶、逆转录酶等分子生物学常用工具酶一一被中国企业攻克，实现了国产替代。但国内限制酶市场从Promega，到后来的NEB、Fermentas/ThermoFisher、Takara三分天下，还是难觅中国企业身影。

限制酶大规模生产为什么这么困难？主要有三个原因。第一，限制酶能够切割基因组DNA，在工程细菌中重组表达会引起细胞毒性，需要耗费大量精力筛选保护菌株和发酵工艺；第二，限制酶品种众多，单做几种不能满足市场需求，但不同限制酶之间氨基酸序列差异大，性质不同，工艺需要逐个攻克；第三，限制酶产品中不能有其他核酸酶残留，对纯化工艺要求很高。

2015年，一群“不知天高地厚”的年轻人决心要搬掉限制酶这座横亘在中国生物技术发展之路上的大山。他们以中国古代神话《愚公移山》激励自己，将团队也称为“愚公”，并将限制酶研发计划定名为“王屋计划”。2016年，愚公成功获得了首批限制酶产品。

时至今日，愚公生物（含旗下百时美生物）已经推出72种限制酶产品，其中包含62种LightNing系列快切酶、3种GMP级别限制酶和2种切刻内切酶，覆盖了90%以上的限制酶应用场景，2023年国内市场占有率位居第三。

以限制酶为基础，愚公生物建立了国内领先的毒性蛋白研发平台，将产品线进一步拓展到其他毒性蛋白工具酶。未来，愚公生物将继续坚持“创造酶好生活（Best Enzyme for Better Life）”的愿景，继承老一辈科学家的精神，不断守正创新，为中国生物医学行业提供更多优质、经济、方便的工具酶产品，助推中国生物医药产业发展。