限制性内切酶的前世今生
对于分子生物学和基因工程的从业者来说，限制性内切酶（Restriction Enzymes，简称限制酶或内切酶）是再熟悉不过的工具，在中学生物教科书中就有相当篇幅的描述。限制酶能够识别特定的DNA序列，并将DNA切开，被称为DNA的“分子剪刀”。有了限制酶，人类才能够开始对基因进行各种编辑操作。可以说，没有限制酶，就没有基因工程。今天，我们就走进第一代基因编辑工具——限制酶的前世今生。
01 限制性内切酶的发现
限制性内切酶的发现和制备，使得人类可以开始对基因进行剪切、组合等编辑操作，标志着基因工程技术的诞生。因发现限制性内切酶及其在分子遗传学方面的应用，Werner Arber、Daniel Nathans和Hamilton Smith共同获得了1978年诺贝尔生理学或医学奖。
图二 瑞典1989年发行的诺贝尔奖纪念邮票。票面为限制酶切割DNA分子示意图，左下方有三位获奖者的名字
02 限制性内切酶的商业化历程
图三 限制酶的商业化历程
1974年，美国科学家Donald Comb辞去了哈佛医学院生物化学系副教授的职位，在自家车库里创办了New England Biolabs（NEB）公司。1975年NEB推出的首批产品包含18个限制酶，第一年就实现了20万美元的销售收入，在那个年代是一笔非常丰厚的回报。此后，NEB始终秉承“By scientist, For scientist”（由科学家创建，为科学家服务）的精神，为分子生物学工作者提供各种优质的工具酶，仅限制酶产品就有270种，成为该领域的领军企业。
图四 NEB创始人Donald Comb (1927-2020)
在NEB发展历程中还有一位关键人物Richard Roberts。1972年，他在聆听了Daniel Nathans关于限制酶应用的报告后，立即决定转投这个领域。在1974年NEB创立之初，Roberts就担任顾问兼科学咨询委员会主席。他率先收集了各种已发现的限制酶信息，建立了第一个限制酶数据库——REBASE，并由NEB维护至今。1992年，Roberts全职加入NEB担任首席科学家直至今日。1993年，Richard Roberts因为发现断裂基因（即基因由外显子和内含子组成），而与Phillip Sharp共同获得诺贝尔生理或医学奖。
图五 NEB首个限制酶产品目录
与此同时，冷战铁幕另一边的苏联也在分子生物学领域进行着积极的探索。早在1962年，苏联政府就决定建立5个酶工厂，其中3个位于俄罗斯，1个位于哈萨克斯坦，1个位于立陶宛。立陶宛工厂于1970年建成，1971年投产，厂区内的生物技术研究所也开始运营。1975年，苏联应用酶学研究所在立陶宛成立，Arvydas Janulaitis在此研发出苏联的第一个限制酶，并与NEB一起不断丰富着REBASE。
图六 苏联时期的立陶宛酶工厂及生物技术研究所
1990年，立陶宛等波罗的海三国宣布脱离苏联独立，应用酶学研究所也随之拆分，留在立陶宛的Arvydas Janulaitis等人成立了MBI Fermentas，继续从事分子生物学工具酶的商业化开发，陆续推出了188种限制酶产品，成为世界第二大限制酶供应商。2010年，Fermentas被ThermoFisher Scientific整体收购。
图七 2003年，理查德·罗伯茨（左起第5）带领NEB团队（左起第4-6）访问Fermentas时合影，最右为Arvydas Janulaitis
而在太平洋西侧，成立于1925年的宝酒造株式会社（Takara Shuzo）也不满足于在食品发酵行业的成就，决定进军生物酶领域。1979年，Takara推出了第一款限制酶产品。2002年，Takara的生命科学事业部独立为Takara Bio，现拥有90种限制酶产品，成为世界第三大限制酶供应商。除此之外，还有Roche、Promega、Toyobo等知名生物技术企业也曾自行开发了一些限制酶产品，但均已逐步退出市场。
目前已在各种微生物中发现了4000多种限制酶，其中约400种形成了商业化产品。早期的限制酶产品反应时间较长，往往需要过夜；而且不同的酶在不同的缓冲液中活性差异很大，如果要使用两个酶或多个酶切割同一个DNA分子，用一个酶切完之后，需要换用不同的缓冲液再加入第二个酶，使用起来非常麻烦。2006年，Fermentas率先尝试通用缓冲液和快切，推出了FastDigest系列产品，这系列产品能够在通用的FastDigest缓冲液中，仅需5-15分钟即可完成酶切反应，大大方便了用户。然而，第一代FastDigest系列仅有19个产品，选择余地太小，未能产生太大反响。2011年，收购了Fermentas的ThermoFisher重磅推出176种FastDigest系列快切酶，轰动了整个领域。随后，Takara在2012年也推出了QuickCut系列快切酶，不过仅有37种产品。2013年，“老大”NEB终于也推出了Time-Saver系列快切酶，现有超过180种产品。限制酶全面进入快速时代。
03 限制性内切酶的国产化
时至今日，愚公生物（含旗下百时美生物）已推出63种限制酶产品，其中包含56种LightNing系列快切酶，覆盖了90%以上的限制酶应用场景，2022年国内市场占有率达到6%。未来愚公生物将继续坚持“创造酶好生活（Best Enzyme for Better Life）”的愿景，不断守正创新，为中国生物医学行业提供更多优质、经济、使用方便的工具酶产品，助推中国生物医药产业发展。
