干货分享 | 你的RT-qPCR内参选对了么？
众所周知，在研究基因表达水平时，往往使用逆转录-荧光定量PCR（即RT-qPCR）对目标基因进行相对定量。这就需要设定在不同条件下表达量都相对恒定的基因作为内参 (internal control gene或reference gene)。一般来说，大家习惯选择一些常见的管家基因（house-keeping gene），如β-Actin (ACTB)、Actin-2 (ACT2)、GADPH、18S rRNA等。因为这些基因通常是维持细胞基本生命活动所必需的，所以人们认为无论组织类型、发育阶段、细胞周期状态或外部信号如何，这些基因的表达量都相对稳定，可以被用作内参。
然而，事实真的是这样么？
随着研究的深入，研究者重新审视了以往认为表达量“稳定”的那些house-keeping gene基因，发现这些基因的表达水平并不是一成不变的，而是会随着物种差异、组织类型差异、发育阶段而发生变化，尤其是在某些病理或实验条件下变化尤为显著。如果不加分析地直接选用此类基因作为内参，会对实验结果、数据分析带来极大误导。
下面让我们来看几个例子。
01 拟南芥
2013年，研究者通过RT-qPCR和Microarray两种技术分析了拟南芥的12种内参基因在铁缺乏条件下的表达量，发现经常使用的ACT2基因在不同条件下表达水平差别可以达到2倍，而3个不常用的基因SAND、YLS8和TIP41-like表达量反而相对稳定（图1）。
图1 铁缺乏条件下的基因相对表达量
02 小鼠
2022年，研究者使用5种不同算法，分析了小鼠骨骼肌中常用内参基因的表达量稳定性，并按表达稳定性从高到低排序。结果表明，常用的GADPH和18S rRNA排名都相当靠后，表达水平稳定性较差（图2）。
图2 小鼠模型中参考基因表达水平稳定性的综合排序
03 人
2015年，有研究者综述了人类不同癌种研究中使用的内参基因，发现不同癌种适用的内参基因存在较大差异。例如乳腺癌适合使用PUM1、ACTB等内参基因；而对于胃癌，则可使用B2M、18S rRNA等基因作为内参。
既然任何实验条件下都能稳定表达的内参基因几乎不存在，那么实际工作中应当怎么选择RT-qPCR的内参基因呢？
▶ 查阅文献和数据库
检索同样物种、类似条件（疾病）是否已有内参基因相关研究。
亦可参考国家生物信息中心建立的RT-qPCR内参基因数据库：https://ngdc.cncb.ac.cn/icg/。
▶ 使用多个内参基因
无论选择哪个内参基因，在不同条件下单个基因的表达水平始终存在一定差异，最好的策略是使用2个以上的内参基因。对人肺癌基因表达水平的研究表明，联合使用3-4个基因作为内参可以大幅提升稳定性（图3）。
图3 五种条件下人肺癌内参基因/组合的表达稳定性排名
▶ 使用软件分析内参基因稳定性
已有多种软件用于分析内参基因结果的分析，常用的分析工具有：
-
geNorm （https://genorm.cmgg.be/） -
NormFinder（https://www.moma.dk/software/normfinder） -
BestKeeper （https://www.genequantification.com/bestkeeper.html） -
RefFinder （http://blooge.cn/RefFinder/）
其中，geNorm和NormFinder下载安装比较麻烦，已有好心网友二次开发的网页版供使用：https://seqyuan.shinyapps.io/seqyuan_prosper/。
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参考文献：
1. Han et al. (2013)Biometals. 26:403–413
2. Ma et al. (2022) PeerJ. 10:e14221
3. Sharan et al (2015) Cell Oncol. 38:419-431
4. Gu et al (2023) Front Oncol.13:1178629
