酶切杂带的罪魁祸首？全面了解星号活性
我们知道，限制酶作为DNA的“分子剪刀”，一般都是老老实实识别特定的DNA序列，并在特定的位置切开DNA。但有时，如果条件不合适，限制酶也会展现出一些“调皮”的行为，这就是所谓的“星号活性”（star activity）。
01 星号活性的发现
早在1975年，科学家们在研究限制酶EcoRI（典型酶切位点G↓AATTC）时就发现，如果把反应缓冲液中的离子强度降低，同时把pH值提高到8.5，EcoRI就会失去对两侧碱基的特异性，酶切位点变成N↓AATTN，即识别位点从六碱基变成了四碱基（图1）。1978年，德国科学家Hubert Mayer进一步发现，如果提高反应液中的甘油等有机物浓度，EcoRI等限制酶也会出现类似的非典型位点切割现象。Mayer在论文标题里，用EcoRI*-activity来表示这种非最优条件下的非典型切割现象，并在论文正文中首次提出了star activity概念。
图1
02 为什么叫“星号”活性
大家一定很好奇，为啥要用“星号活性”这个词来描述限制酶这种非典型切割的活性呢？很可惜，首次提出这个概念的Mayer在论文里并没有说明原因。不过有两种说法来解释这个有意思的命名：
一种说法是，当反应条件发生变化时，限制酶出现了意想不到的行为，就像一颗游荡的星星（Star），在典型切割位点之外的其他位置切割DNA。因此使用star activity一词来描述这种不可预测的行为。
还有一种说法是，如果将典型的限制酶识别序列想象成地图上的主要路径，当限制酶处在非最优条件下时，会偏离主路径，朝其他方向运行，类似星形符号（*）的分叉。所以将这种活性命名为star activity。
03 星号活性是随机切割的么？
虽然星号活性是在典型位点之外的非特异性切割，但从最初对EcoRI的研究中大家就能看出来，星号活性也不是完全随便乱切的，只能叫部分非特异性切割。目前认为，星号活性是限制酶的内在性质，在非最优条件下，几乎所有限制酶都可能产生星号活性。目前研究者只鉴定出少数限制酶的星号识别序列，每种酶产生星号活性的机制也不一定完全相同，相关研究还比较缺乏。在《限制性内切酶在中国》一文中我们提到，中国的结构生物学家在这方面的研究走在世界前列。
04 星号活性受哪些因素影响
导致星号活性产生的因素有很多，比如限制酶过量、孵育时间过长、反应液中甘油浓度过高（＞5% v/v）、低盐浓度（＜25 mM）、非最佳pH、存在其他有机溶剂、存在除Mg2+之外的二价阳离子等（图2）。
图2 某限制酶星号活性展示
05 如何控制星号活性
绝大多数情况下，星号活性对酶切反应都是有害的，因此在实验中，我们应当采取措施避免出现星号活性。一般而言，使用厂家随酶提供的缓冲液，参照厂家说明书给出的反应条件进行实验就不会出现星号活性。但实际酶切反应操作中仍需遵循以下原则：
▶ 控制酶量和反应体积。限制酶一般贮存在50%甘油中，因此总酶量不应超过反应总体积的10%（例如双酶切总反应体积为20 μl，则两种酶合计加入的体积不应超过2 μl）。反应液体积不宜过小，以免反应过程中水分蒸发提高甘油浓度。
▶ 选择能完全切割所需的最短时间，过长反应时间可能会引起星号活性。
▶ 使用推荐的缓冲液，不同离子强度和pH值的缓冲液可能会引起星号活性。
▶ 确保反应体系中不含其他有机溶剂，如制备DNA过程中可能会混有的乙醇。
▶ 反应液中注意不要含有Mg2+之外的二价阳离子，其它二价阳离子不适合限制酶的活性位点，会对其正确识别造成干扰。
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