探秘T4连接酶：基因“分子缝合针”

       在高中的生物课教材里，就告诉我们基因工程至少需要三种工具：“分子手术刀”、“分子缝合针”和“分子运输车”。之前我们已经了解了“分子手术刀”——限制性内切酶的前世今生，今天我们就来聊聊最常用的“分子缝合针”——T4 DNA连接酶。

       1967年，科学家们在侵染大肠杆菌的T4噬菌体中发现了一种酶，能够将断裂的双链DNA连接起来，于是命名为T4 DNA连接酶。后来发现T4连接酶不仅能够连接双链DNA，也能修复双链DNA、DNA-RNA杂合链上的切刻，就像是一套万能的缝合针。T4 DNA连接酶在缝合DNA时需要两端有能穿针的“搭扣”，即3'末端的自由羟基和5'末端的磷酸基团，同时还需要ATP参与提供能量。

       因为要精确连接DNA末端，所以T4 DNA连接酶对纯度要求很高，微量其他核酸酶的污染就会破坏DNA末端导致连接失败。愚公&百时美T4 DNA Ligase (Fast) 经过精细纯化，纯度与进口产品相当，优于国内竞品。

       T4 DNA聚合酶可以连接各种类型的双链DNA末端，无论是末端有突出 (overhang) 的粘性末端 (sticky end)，还是末端平齐的粘性末端 (blunt end)。

       对于不同类型的DNA末端，连接效率差异较大。一般而言，粘性末端的连接效率远高于平末端；对于粘性末端，4碱基突出的连接效率高于2碱基突出，但单碱基突出的粘性末端连接效率有时也接近平末端。根据我们的数据，3'突出末端的连接转化效率高于5'突出末端。此外，突出序列CG含量高的连接效率更高。

       T4 DNA连接酶的用量对于连接反应的效率有很大影响，但不同公司对T4 DNA连接酶的活性定义方式差别较大。在使用之前一定要仔细阅读产品说明书，确保所用的“缝合针”是适合实验需求的。

下表列出了愚公&百时美T4 DNA Ligase (Fast)和其他几种常见T4 DNA连接酶的活性定义和换算比例（根据各家说明书数据），供参考。

愚公&百时美T4 DNA Ligase (Fast)