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探秘T4连接酶:基因“分子缝合针”

发布时间:2024-05-22 发布人:
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       在高中的生物课教材里,就告诉我们基因工程至少需要三种工具:“分子手术刀”、“分子缝合针”和“分子运输车”。之前我们已经了解了“分子手术刀”——限制性内切酶的前世今生,今天我们就来聊聊最常用的“分子缝合针”——T4 DNA连接酶。

 

一、 T4 DNA连接酶来自噬菌体的神秘力量

       1967年,科学家们在侵染大肠杆菌的T4噬菌体中发现了一种酶,能够将断裂的双链DNA连接起来,于是命名为T4 DNA连接酶。后来发现T4连接酶不仅能够连接双链DNA,也能修复双链DNA、DNA-RNA杂合链上的切刻,就像是一套万能的缝合针。T4 DNA连接酶在缝合DNA时需要两端有能穿针的“搭扣”,即3'末端的自由羟基和5'末端的磷酸基团,同时还需要ATP参与提供能量。

       因为要精确连接DNA末端,所以T4 DNA连接酶对纯度要求很高,微量其他核酸酶的污染就会破坏DNA末端导致连接失败。愚公&百时美T4 DNA Ligase (Fast) 经过精细纯化,纯度与进口产品相当,优于国内竞品。

 

二、 不同类型末端的连接效率

       T4 DNA聚合酶可以连接各种类型的双链DNA末端,无论是末端有突出 (overhang) 的粘性末端 (sticky end),还是末端平齐的粘性末端 (blunt end)。

       对于不同类型的DNA末端,连接效率差异较大。一般而言,粘性末端的连接效率远高于平末端;对于粘性末端,4碱基突出的连接效率高于2碱基突出,但单碱基突出的粘性末端连接效率有时也接近平末端。根据我们的数据,3'突出末端的连接转化效率高于5'突出末端。此外,突出序列CG含量高的连接效率更高。

 

三、 活性定义的差别

       T4 DNA连接酶的用量对于连接反应的效率有很大影响,但不同公司对T4 DNA连接酶的活性定义方式差别较大。在使用之前一定要仔细阅读产品说明书,确保所用的“缝合针”是适合实验需求的。

下表列出了愚公&百时美T4 DNA Ligase (Fast)和其他几种常见T4 DNA连接酶的活性定义和换算比例(根据各家说明书数据),供参考。

 

四、 T4 DNA连接酶使用注意事项

       首先,T4 DNA连接酶比较“娇贵”,最适反应温度在22℃左右,很容易失活,取用时一定要注意冰上操作,取完后立即放回-20℃保存。此外,普通T4 DNA连接酶对Na+、K+等一价金属离子的耐受性也比较差。
       其次,T4 DNA连接酶的连接效率受到酶的用量、目的片段与载体浓度及摩尔比、载体大小、DNA纯度等因素的影响较大,需要仔细阅读说明书,并根据自己的实验调整。
       第三,一定分子量的聚乙二醇 (PEG) 能极大提高平末端的连接效率,可根据连接反应体积的5%酌情添加。

 

愚公&百时美T4 DNA Ligase (Fast)

01 超高纯度

02 连接效率高

03 反应快速(室温下10 min即可完成粘性末端连接)

 

五、 相关产品

 

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