选择限制酶用于mRNA疫苗生产的6条建议

       2024年5月底，美国FDA批准了Moderna公司的第二款mRNA疫苗——针对呼吸道合胞病毒（RSV）的mRESVIA（mRNA-1345）。这是全球获批的首款非新冠mRNA疫苗。再次展现了mRNA疫苗的巨大潜力。

       在mRNA疫苗的开发和生产过程中，将包含有抗原基因的环状质粒DNA变成线状DNA，作为此后体外转录反应的模板，是非常关键的步骤。这一步主要通过限制性内切酶的定点酶切反应完成。

       在此，愚公生物为选择mRNA疫苗开发限制酶提供如下建议：

01 选择识别序列较长的限制酶

       质粒线性化的首要要求就是酶切位点不能出现在抗原基因的内部。6碱基以上的识别序列，出现在基因内部的可能性比较小，减少了基因序列的设计难度。因此需要选择具有较长识别序列的限制酶。

02 酶切产物末端应为5'突出

       限制酶酶切产物末端应该为5'突出，因为5'突出末端出现在体外转录的模板链上。而编码链末端的3'突出，会增加体外转录产生双链RNA (dsRNA) 副产物的风险。

       如下图所示，BsaI、XbaI、XhoI酶切产物均为5'突出。而PstI、SacI酶切产物均为3'突出，不适合用于mRNA质粒模板线性化。

03 无需拘泥于Type IIS限制酶

       一般认为，Type IIS限制酶是质粒线性化的首选，因为Type IIS限制酶的酶切位点在识别位点之外，且切割不受序列限制，可以产生不含任何多余序列的模板。

       但实际上很多药企已经证明，Type IIP限制酶，如XbaI、XhoI、NheI、EcoRI等同样可以用来进行质粒模板线性化，并不会影响mRNA疫苗的效果和安全性。也有部分研究表明，如果poly(A)尾的3'末端带有额外的酶切位点，还有可能增加mRNA的稳定性。

04 无动物源性

       生物制品中的动物源成分存在安全和质量风险，各国药典都要求优先考虑使用无动物源材料。

       愚公生物推出的GMP和ADCF（无动物源性成分）系列限制酶，采用化学成分明确、无动物源性和无人源性成分培养基表达，并经过多步的层析纯化获得。产品的表达、纯化和制剂等工艺过程中没有使用含动物源性和人源性成分的试剂，也未使用氨苄青霉素及其他抗生素。生产设施和包装材料也没有使用动物或者动物制品或动物病原体。此外，愚公生物的所有酶制剂最终配方中不含有牛血清白蛋白，取而代之的是更安全可控的重组白蛋白（rHSA）。

05 关注使用后残留

       限制酶作为中间原料，在完成反应后就属于工艺相关杂质，需要及时去除，避免带来未知风险。根据法规，对生物制品制造过程中的残留原料蛋白要进行过程控制检测。为此，愚公生物推出了多种限制酶的残留检测试剂盒（见新品推介l限制酶BsaI残留检测试剂盒），用于mRNA原料质量控制。

06 关注酶的稳定性

       疫苗与药物开发与生产对工艺稳定性要求极高。限制酶作为关键原料之一，其储存稳定性也直接影响了工艺的效果。因此应当尽量选择稳定性更好的酶。

       此外，酶的最适反应温度可能也会影响mRNA质粒模板线性化的效果，但对于这个因素业内尚无明确的共识，所以可以根据自身的需求选择。

       愚公生物拥有国内领先的GMP-like原料酶生产线，提供多种GMP级别和无动物源性限制酶，并接受无动物源性限制酶定制，为国内外mRNA疫苗开发与生产提供优质原料。

                                                        愚公生物车间图

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