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  SDS-CN-EG24501-LightNing® DdeI

相关问答

• Q:

  为什么在CutOne® Buffer中加入HSA？

  A:

  一些酶在反应过程中需要HSA的参与，我们在CutOne® Buffer中添加了HSA，避免反应中额外添加组分，使得酶切反应更加便捷。

• Q:

  HSA的添加对于雷霆系列限制性内切酶的功能会产生什么样的影响？

  A:

  在我们的测试中未曾发现HSA对于雷霆系列限制性内切酶的功能有任何影响。在有些情况下，对于部分的酶切反应有促进作用。

• Q:

  为了保证酶量小于体系的1/10多酶切时往往可加入酶量较少，从而导致酶切不完全，如何解决？

  A:

  说明书中给出的是最佳反应体系，可以根据具体需求进行适当调整。

  酶切不完全的问题可以从这几个方面进行解决：降低底物浓度，提高酶量同时扩大反应体系，或者适当延长反应时间。

• Q:

  我需要严格遵守5~15 min的酶切时间吗？能够延长反应时间吗？

  A:

  雷霆系列限制性内切酶经过改造可以将酶切时间缩短至5~15 min。同样也消除了限制性内切酶的星活性（长时间反应造成的非特异性消化），在说明书中告知的星活性出现的时间范围内可以适当延长反应时间。

• Q:

  酶切反应完成后终止反应是不是必要的？我该如何终止我的酶切反应

  A:

  限制性内切酶对于下游反应（连接与转化等）有影响，部分限制性内切酶能与双链DNA结合，对于凝胶电泳会产生影响；而且不失活酶切产物不能保存。故反应完成后应对其进行失活处理。常规失活方式为高温热失活，对应各个限制性内切酶的失活温度请查阅说明书。另，部分上样染料中含有SDS可使蛋白变性，苯酚或氯仿的萃取也能使反应终止。

• Q:

  我什么时候应当考虑星活性对于酶切反应的影响？

  A:

  如果额外的酶切条带对于实验结果会产生影响时我们应当考虑星活性对于酶切反应的影响。例如：进行基因型、突变型分析或克隆时我们应当避免星活性的产生。避免星活性的有效方法：适当扩大反应体积（较小的反应体积容易造成甘油体积达到或超过总反应体积的5%）；不进行超长时间孵育（过夜消化极易产生星活性）。

• Q:

  酶切反应的具体操作流程是怎样的？

  A:

  大部分的科研工作者通常遵循如下流程：1 U限制性内切酶可以完全酶切1μg经过纯化的DNA，总体积为20 μl于1×CutOneTM Buffer环境下进行反应。为防止总酶量超过总体积的10%，在双酶切时可以适当扩大反应体系。千万不要孵育超过星活性出现的时间（星活性出现时间请查阅各酶说明书）。另外一个容易被忽略的问题对于酶切的影响也非常大，在反应体系配制完成后完全的混匀才能反应完全，推荐用枪头轻轻吹打3到5次或用手指轻弹管壁，之后用离心机瞬离即可。不要涡旋反应体系，剧烈震荡对酶的活性有极大的影响。

• Q:

  酶切反应完成后，没有看到切割后的迹象，有哪些因素可能对酶切产生抑制作用？

  A:

  作为酶切反应底物的DNA应该是纯净的没有污染的，其中例如：苯酚、氯仿、酒精、EDTA、去污剂、过量的盐都会抑制酶切反应。部分酶对于DNA的二级结构较为敏感，DNA的缺刻、超螺旋都会对反应产生影响。另外很多限制性内切酶对于DNA的甲基化非常敏感，确保DNA的甲基化类型不会阻止限制性内切酶的反应。如果找不到您的酶切反应不能进行的原因，我们推荐对照DNA底物（有多个酶切位点的DNA底物例如lambda DNA），进行对比反应。如果对照DNA底物能够被切开而您的底物仍旧不能被切开，将两种DNA底物进行混合，进一步确保DNA底物中不存在能够抑制限制性内切酶反应的物质。

• Q:

  超长时间的孵育（孵育时间超过1 h）对于酶切是否存在影响？

  A:

  雷霆系列限制性内切酶的酶活定义是以15 min反应时间为标准的。增加反应时间应该对应着减少酶的用量，值得注意的是不同的DNA底物对于酶的需求量是不一样的。为了使DNA底物反应完全同时避免非特异切割，使用前一定要仔细查阅酶的反应浓度、反应温度、反应时间、星活性出现时间等。

• Q:

  限制性内切酶简并性识别位点一定是回文的吗？

  A:

  大多数二型限制性内切酶的识别序列是回文的，而且是特定的碱基序列。然而有些限制性内切酶具有简并性识别位点，也就是说识别位点中有一个或以上的碱基对是非特异的（例如：BsrfI识别5’RCCGGY, R=A/G, Y=C/T）。对于这样的具有简并性识别位点的限制性内切酶，只要是符合要求的序列皆能被识别并且被正确地切割（例如5’ ACCGGC, 5’ ACCGGT, 5’ GCCGGC, 和5’ GCCGGT，其中两个并不是回文的，仍然能被BsrFI识别并且切割）。

• Q:

  雷霆系列限制性内切酶的稳定性如何？运输过程中冻融会对酶的活力产生影响吗？

  A:

  运输过程中以干冰保持低温运输，酶有结冰的可能，但是这对于雷霆系列的限制性内切酶的质量没有影响，我们对所有的酶都进行了至少三次的冻融实验，检测结果表示，酶的活性仍旧是100%。您收到的酶可能是冰袋运输的，请不要担心，这仅仅是由当地的经销商运到您的实验室过程中采取的运输方案，我们经过严格的检测，暴露在4℃下经过24~48 h后仍然不受影响。

• Q:

  除了高温还有什么方法能够让雷霆系列限制性内切酶失活？（也不想用苯酚或氯仿）

  A:

  可以使用EDTA终止反应，或者以SDS等蛋白质变性剂使得酶变性。如果酶切产物还要用于下游实验那么可以用胶回收试剂盒进行DNA清洁，回收后酶切反应就被终止了。

• Q:

  酶切反应完成后跑凝胶电泳，结果条带与预期不符，可能原因有哪些？

  A:

  可能原因有如下几个：

  　　•　限制性内切酶表现出星活性：确保酶切反应是严格按照说明书推荐的步骤进行的。如果是由星活性引起的那么有以下几个解决方法：①减少反应时间；②增加反应体系的体积；③减少反应中酶的含量。

  　　•　酶切不完全（一个或多个酶切位点有部分DNA底物未被切开），可以尝试加多酶量或者延长反应时间。如果上面的尝试不能很好地解决问题，请从DNA底物上寻找解决方案，DNA底物中是否含有酶切反应抑制剂，将DNA纯化后再进行反应；DNA是否被甲基化，胞内的甲基化系统能够使DNA的特定碱基发生甲基化，而这些甲基化的碱基对于酶切反应有着不同程度的抑制。

  　　•　被未知限制性内切酶污染：未知的限制性内切酶可能通过不当的操作、不纯净的DNA底物、不洁净的管子等途径掺入酶切反应中。

• Q:

  有哪些关键因素会导致星活性？

  A:

  长时间孵育、过量的酶、高甘油含量（通常高于5%）、较小的反应体系等因素都会导致星活性的产生。

• Q:

  未经纯化的PCR产物直接酶切要怎样设定体系？

  A:

  反应体系推荐由这些内容组成：10 μl PCR产物、2 μl 10×CutOneTM Buffer、1~2 μl相应的限制性内切酶、ddH2O补齐到30 μl。酶的用量根据PCR产物的浓度而定，只加入2 μl反应缓冲液的原因是PCR反应中存在对应的盐离子和金属离子，适当减少反应缓冲液的用量以保证最终反应体系中的环境适宜限制性内切酶发挥功能。

• Q:

  雷霆系列限制性内切酶的活力定义是怎样的？

  A:

  雷霆系列限制性内切酶1 U的定义是正好在15 min于20 μl的反应总体系中将1 μg的 DNA底物在1×反应缓冲液的环境中完全消化所需求的酶量。

• Q:

  雷霆系列限制性内切酶的活力单位与Thermo Fisher的活力单位或者 NEB的活力单位应该如何换算？

  A:

  由于反应时间，反应体系不同，活力单位无法直接换算。雷霆系列限制性内切酶活力单位是依据反应进行定义的，正好在15 min于20 μl的反应总体系中将1 μg的 DNA底物在1×反应缓冲液的环境中完全消化所需求的酶量为1 U，也就是说反应中加入与DNA底物成比例的酶量即可完成反应。