某些限制酶对同一底物的不同位点切割效率不同，这种现象被称为位点优势效应(Site Preferences)。
例如 NarI，它表现出明显的位点偏好性，在 pBR322 上 548 bp 位置的 NarI 位点处，酶切十分缓慢。

切割超螺旋所需酶量一般比切割线性 DNA 要多。通常在标准反应体系中切割超螺旋 DNA 所需的酶量是切割 λDNA 的 3~5 倍。

同裂酶（isoschizomer）：识别相同核苷酸序列的限制酶互为同裂酶，例如：BsmBI 与 Esp3I 均识别 CGTCTCNNNNN。对同裂酶的定义有两种观点：一种观点认为识别相同序列且在相同位置切割的酶才能称为同裂酶；另一种认为只要识别相同序列即为同裂酶，该观点认为下文提及的异裂酶也是同裂酶的一部分。同裂酶之间反应温度、反应缓冲液、甲基化敏感性、星号活性等可能不同，不能简单替换。

• 底物中无所选限制酶的酶切位点，可能是由于序列突变或其他因素导致。
• 很多限制酶对于 DNA 的甲基化非常敏感，应确保 DNA 的甲基化类型不会阻止限制酶反应。
• 某些质粒提取试剂盒提取的底物带有杂质，会抑制酶切反应。
• 部分酶需要 2 个及以上的识别位点才能进行切割，如 SfiI。

原因（1）载体自连。
解决方法：载体去磷酸化不彻底。通过对去磷酸化的载体连接和转化来验证。使用碱性磷酸酶对载体进行去磷酸化处理。
原因（2）仍存在未被酶切的载体。
解决方法：通过转化酶切后尚未进行连接的载体来验证。对酶切后的载体进行凝胶回收后再用于连接。
原因（3）插入片段对细胞有毒性。
解决方法：1. 尝试在较低温度（30℃或室温）培养细菌。克隆出现将需要更长时间。
2. 尝试使用不同菌种。
原因（4）使用的抗生素浓度过低。
解决方法：使用正确浓度的抗生素。
原因（5）抗生素发生降解。
解决方法：使用无抗性的感受态细胞进行平板涂布，以确认抗生素筛选是正常工作的。

大多数实验人员遵循的一般原则是10 U的限制性内切酶足以克服DNA来源、数量和纯度的不确定性。通常是在50 μl体系，适合的 1×反应缓冲液中，1 μg纯化的 DNA 中加入1 μl酶，，然后在推荐温度下孵育1小时。如果使用了过量的酶，为了省时，通常可以缩短孵育时长。
为了保证反应体系中甘油浓度低于5%，以 50% 甘油形式提供的限制性内切酶不应超过总反应体积的 10%。
一个成功的限制酶消化的一个极其重要但经常被忽视的因素是混合。反应必须充分混合才能实现完全消化。建议轻柔地上下吹打反应混合物或轻弹管壁。然后在微量离心机中瞬离。切勿涡旋，更多体系和限制酶反应的具体信息，请参阅对应每个限制酶的产品说明书。

表达其他蛋白时，只替换superfolder GFP会残留N端的标签，如果不需要标签替换从ATG到TAA整个翻译区。

可以，例如pET9a、pET23a等质粒也可以，重点是T7启动子到T7终止子序列不建议替换，质粒骨架可以换。

5’UTR是优化的，不建议替换。T7启动子到T7终止子区域不建议替换，如果该区域有优化需求可自行尝试优化，其它区域都可以优化和替换。

模板DNA浓度低于4 ng/μl，会降低表达量。模板DNA加入量和蛋白表达量有关，建议根据蛋白优化，一般8 ng/μl左右就可以。