大概有以下两种原因，解决方法也附上，供您挑选使用：
（1）原因：限制酶与底物DNA 结合。

解决方法：
• 降低使用的酶量；
• 在上样缓冲液中加入 SDS（0.1~0.5%）以分离与 DNA 结合的酶，或使用 6× SDS DNA Loading Buffer；
• 用蛋白酶 K 处理产物

（2）原因：核酸酶污染。

解决方法：
• 使用新配制的无杂质的电泳缓冲液和新配制的琼脂糖凝胶；
• 纯化 DNA。

1.什么是甲基化？
细胞中普遍存在各类甲基转移酶，能够将甲基供体上的甲基转移到腺嘌呤或胞嘧啶上，使 DNA 被甲基化修饰。而在体外通过 PCR 扩增获得的 DNA 片段则一般无甲基化修饰。甲基化修饰通常会导致对甲基化敏感的限制酶切割受影响或完全阻断。
2.原核生物甲基化
分 子 生 物 学 中 普 遍 使 用 的 部 分 大 肠 杆 菌 菌 株（ 如 JM109、HB101 等）还含有 4 种位点特异性的甲基转移酶，分别是：Dam 甲基转移酶（形成GmATC）、Dcm 甲 基 转 移 酶（ 形 成 CmCWGG）、EcoKI（形成 AmACNNNNNNGTGC和 GCmACNNNNNNGTT） 和 EcoBI（形成 TGmANNNNNNNNTGCT 和AGCmANNNNNNNNTCA），从这些菌株中提取的质粒 DNA 也会带有相应的甲基化位点。如果所使用的限制酶识别位点与这些甲基化位点有重叠，则可能导致酶切受到阻遏。例如，从基因型为dam+的大肠杆菌中提取的质粒不能被识别序列为 GATC 的DpnII 所切割。因此，对于受 dam 或 dcm 甲基化影响的限制酶，应当使用从dam-或dcm-基因型的大肠杆菌菌株中提取的 DNA，或使用 PCR 扩增获得的 DNA。
3.CpG 甲基化
哺乳动物细胞内普遍存在 CpG 甲基转移酶，会将一部分 CG 序列中的胞嘧啶进行甲基化修饰。如果限制酶酶切位点中包含 CG 序列，则酶切可能受阻。例如，HpaII 识别位点为 CCGG，无法切割被CpG甲基化修饰的 DNA。因此，在消化真核生物基因组 DNA 时，同样需要注意 CpG 甲基化的影响。注意，细菌一般不存在CpG甲基转移酶，因此被转化到细菌中扩繁得到的DNA，一般不存在CpG甲基化形式。

原因（1）转化效率差。解决方法：验证您所用的大肠杆菌感受态细胞的转化效率。
原因（2）连接反应不成功。解决方法：
• 确认载体或插入片段含有一个 5' 磷酸基团。
• 可以尝试连接单酶切后的载体。
• 确保用于制备载体和插入片段的限制酶已经通过酚抽提和缓冲液置换被去除，或者至少已经被灭活。
原因（3）载体和 / 或插入片段的酶切不完全。解决方法：
• 将酶切产物进行凝胶电泳来确认酶切状况。如果酶切不完全，则要进行重新酶切或凝胶纯化酶切完全的片段。
• 如果通过 PCR 引物引入酶切位点。确保在酶切位点的上游有足够的保护核苷酸以实现有效的酶切（保护碱基的数目取决于所使用的限制酶。一般建议至少为 6 个碱基）。
• 确保使用了正确的缓冲液用于酶切。
原因（4）抗生素使用浓度过高。解决方法：确保使用了正确量的抗生素。
原因（5）使用了错误的抗生素。解决方法：确保使用载体上带有的抗性基因对应的抗生素。
原因（6）DNA 损伤或DNA 有切口。解决方法：在凝胶纯化过程中，尽可能减少 DNA 暴露于紫外光的时间。

最好设置对照，便于分析和鉴定酶切反应结果。特别是当酶切不成功时，便于查明原因。
应设置阴性对照和阳性对照，具体为：
1. 阳性对照，使用 λDNA 或其他已知质粒进行酶切，排除酶的质量问题；
2. 阴性对照，反应体系不加酶，便于酶切以后的结果比对。

有少数限制酶识别并仅切割被甲基化修饰的 DNA，如 DpnI 和 SgeI。
DpnI 特异性识别并切割双链 DNA 中腺嘌呤被甲基化修饰的 GmATC 序列（即Dam 修饰），对未被甲基化的 GATC 序列无作用。
SgeI 特异性识别单链或双链 DNA 上胞嘧啶被甲基化的 mCNNG 序列（Dcm 修饰的一种）并在下游切割，不识别未被甲基化的 CNNG 序列。
DpnI 和 SgeI 可以被用来进行 DNA 定点突变。从dam+ 或dcm+ 基因型菌株中提取的质粒带有甲基化修饰。如果设计带有突变位点的引物，以甲基化质粒为模板进行PCR 扩增，获得的产物不带有甲基化修饰。这样使用 DpnI 或 SgeI 进行处理，就会只消化未突变的质粒模板，而保留带有突变位点的扩增产物。

限制性反应液中 DNA 浓度的最佳范围是 0.02~0.1 µg/µl。为了避免 DNA 溶液中潜在杂质的抑制，建议在 DNA 量较大时增加反应的总体积。

有些限制酶具有简并性识别位点，也就是说识别位点中有一个或以上的碱基对是非特异的（例如：AccI 识别 GTMKAC，M=A/C，K=G/T）。对于这样的具有简并性识别位点的限制酶，只要是符合要求的序列皆能被识别并且被正确地切割（包括GTATAC，GTAGAC，GTCGAC 和 GTCTAC，其中两个并不是回文的，仍然能被AccI 识别并且切割）。

有些同裂酶的甲基化敏感程度不同，对于甲基化和非甲基化位点能够产生截然不同的产物，可以有效获得甲基化信息。
例如：
DpnI 和 DpnII 可以用于分析 Dam 甲基化
HpaII 和 MspI 可以用于分析 CpG 甲基化

限制酶对于下游反应（连接与转化等）有影响，部分限制酶能与双链 DNA 结合，对于凝胶电泳会产生影响；而且不失活酶切产物不能保存。故反应完成后应对其进行失活处理。常规失活方式为高温热失活，对于无法热失活的限制酶，可以通过酚 / 氯仿抽提或 DNA 纯化试剂盒使反应终止。

从限制酶和双链DNA相互作用的几何结构来看，在分子水平上，限制酶几乎不可能识别并切开单链 DNA。
而某些酶之所以可以切开单链DNA，很可能是因为这些酶识别了这些单链DNA上多个回文结构之间暂时形成的双链DNA。因此，单链DNA的切割受很多因素的影响，这些因素包括：DNA上识别位点的数目，这些位点之间的距离，瞬时二聚体的稳定性（富含 GC 的底物要比富含 AT 的单链 DNA 底物切割效率高）以及在识别位点之外有多少个保护碱基等等。