质粒线性化是分子生物学中常见的操作之一，它的主要目的是为了使质粒更容易被转化进入宿主细胞中。质粒是一种环状DNA分子，通常在宿主细胞内复制，但是在某些情况下，质粒可能会变成线性分子。线性化质粒的过程可以通过限制性酶切来实现，即将质粒切开成线性分子的过程。
质粒线性化的主要优点包括：
1. 更容易被转化：线性化质粒的转化效率比环状质粒高得多。这是因为线性分子更容易与宿主细胞的表面受体结合，从而更容易被导入到细胞中。
2. 增加克隆的稳定性：线性化质粒可以减少克隆的环化倾向，从而提高克隆的稳定性。这对于那些需要维持单一拷贝插入的基因来说尤为重要。
3. 更容易进行序列分析：线性化质粒可以更容易地确定克隆的序列，因为它们不需要进行 circularization 反应。
在进行质粒线性化时，有一些注意事项：
1. 确认限制性酶切位点：限制性酶切位点必须存在于质粒图谱中，并且必须与所需切点邻近。
2. 确认限制性酶的缓冲液和底物：限制性酶必须在正确的缓冲液和底物条件下进行反应。
3. 进行高效的酶切反应：为了获得高效的酶切反应，必须添加足量的限制性酶和正确的反应条件（如温度和时间）。
4. 确认线性化产物的大小：通过凝胶电泳分析确认线性化产物的大小是否正确。
5. 确保试剂的质量：必须使用高质量的试剂来进行限制性酶切反应，以确保得到正确的结果。
总之，质粒线性化是一种常见的分子生物学操作，可以提高转化效率和克隆的稳定性，并且更容易进行序列分析。在进行质粒线性化时，必须注意限制性酶切位点、缓冲液和底物、高效的酶切反应以及线性化产物的质量。

原因（1）出现星号活性。解决方法：
• 使用随酶提供的推荐缓冲液；
• 酶切时间缩短至 5~15 min；
• 适当扩大反应体积（较小的反应体积容易造成甘油体积达到或超过总反应体积的 5%）；
• 不进行超长时间孵育（过夜消化极易产生星活性）；
• 减少反应中酶的含量；
• 降低甘油含量（通常不高于 5%）。
原因（2）如果胶中出现比预期更大的条带，这可能是由于酶与底物结合。解决方法：
• 降低使用的酶量；
• 在上样缓冲液中加入 SDS（0.1-0.5%）以分离与 DNA 结合的酶。
原因（3）限制酶切割不完全。解决方法：详见：酶切不完全可能的原因有哪些？有什么解决方法？
原因（4）被未知限制酶污染。解决方法：不洁净的管子等途径掺入酶切反应中，此时应更换未开封的新酶。

• 酶从冰箱取出后请一直置于冰上。
• 注意反应缓冲液的终浓度为 1×。
• 酶最后加入到反应体系中。
• 加入酶之后将反应混合液混匀，可以用移液枪上下吹打或轻弹管壁，然后在离心
机中瞬时离心。切忌振荡混匀。
• 避免 DNA 样品中酚、氯仿、乙醇、EDTA、去垢剂或过多盐离子的污染。
• 注意底物 DNA 甲基化对所用限制酶的影响。
• 加入酶液不应超过总体积的 10%，以避免甘油过量引起的星号活性。
• 大多数限制酶建议保存在 -20℃，少数建议保存在 -80℃，具体参见说明书。
• 如果您使用的是愚公缓冲液，10× CutOne® 缓冲液应保存在 -20℃。
• 应在保质期内使用。

归位内切酶是双链 DNA 核酸酶，能识别较长的非回文序列 (12~40 bp)。归位内切酶与限制性内切酶不同，没有严格的识别序列。因此，单碱基的改变并不影响其识别功能，但会不同程度地降低其切割速率。

一般情况下，限制酶都是同时切割 DNA 的两条链。但一些特殊的限制酶识别特定的双链序列，只切割双链 DNA 中的一条链，形成切刻（nicking） 状态的DNA 产物。切割产生的单链 5' 磷酸和 3' 羟基末端，可作为很多后续反应的底物，如 DNA 合成置换、链置换扩增、外切降解等。
切刻限制酶的使用方法和普通限制酶一样。由于切刻产物没有完全断裂，因此检测切刻酶活性时，大多检测将超螺旋质粒底物转化为开环状态的能力。

限制性内切酶 （Restriction endonuclease or restriction enzyme） 是一大类可以识别特定核苷酸序列并水解特定位点磷酸二酯键，并产生游离 5' 磷酸和 3' 羟基末端的酶类统称，简称为限制酶或内切酶。限制酶来源于细菌的“限制 - 修饰”系统，最早发现于20世纪60年代末。1978 年，因发现并应用限制酶，Werner Arber、Daniel Nathans 和 Hamilton Smith 共同获得了诺贝尔生理学或医学奖。

一、星号活性
在非理想条件下，限制酶切割与理论切割位点相似但不完全相同的序列，这一现象称为星号活性（Star Activity）。有研究者认为，星号活性可能是限制酶的一种内在性质，如果使酶暴露在特定极端反应条件下，所有限制酶都会出现星号活性。
二、导致星号活性的因素
• 较高的甘油浓度（>5% v/v）；
• 酶与底物 DNA 比例过高；
• 反应时间过长；
• 低盐浓度（<25 mM）；
• 高 pH 值（pH>8.0）；
• 存在有机溶剂（如 DMSO、乙醇、乙烯乙二醇、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺等）；
• 用其它二价离子替代镁离子（如 Mn2+、Cu2+、Co2+、Zn2+ 等）；
注：上述反应条件的改变对于每种酶的影响不同。
三、抑制星号活性的方法
• 尽量降低反应中的甘油浓度。限制酶一般贮存在 50% 甘油中，因此总酶量不应超过反应总体积的 10%；且尽量不要使用过小体积，以免反应过程中水分蒸发提高甘油浓度。
• 选择能完全切割所需的最短时间，延长反应时间可能会引起星号活性。
• 尽可能使用推荐缓冲液。不同离子浓度和 pH 值的缓冲液可能会引起星号活性。
• 确保反应体系中不含其他有机溶剂，如制备 DNA 过程中可能会混有的乙醇。
• 使用镁离子作为二价阳离子，其它二价阳离子不适合限制酶的活性位点，会对其正确识别造成干扰。

大多数星号活性是可以控制的，因此，做酶切反应时一般不需要考虑这方面的因素。只要在正常条件下，使用随酶提供的反应缓冲液，我司限制酶就不会出现星号活性。但是，在双酶切时一种酶的反应条件可能会引起另一种酶出现星号活性。
避免星号活性的有效方法：适当扩大反应体积（较小的反应体积容易造成甘油体积达到或超过总反应体积的5%），避免超过 3 h 孵育。

（1）加入酶量较少：我司说明书中给出的是最佳反应体系，可以根据具体需求进行适当调整。酶切不完全的问题可以从这几个方面进行解决：降低底物浓度，提高酶量同时扩大反应体系，或者适当延长反应时间。
（2）酶切反应底物DNA 被污染：
• 底物中含有过量的盐将抑制反应的发生，需进行 DNA 纯化 / 抽提后进行酶切反应；
• 增大反应体系以稀释污染物，DNA 溶液体积不应超过总反应体积的 25%。
（3）部分酶切割超螺旋困难：通常在标准反应体系中切割超螺旋 DNA 所需的酶量是切割 λDNA 的 3~5 倍，或者延长孵育时间。部分酶即使增加酶量或延时孵育也无法切割超螺旋，此时建议更换限制酶。此类酶常见的酶有NarI、BglI。
（4）PCR 组份的抑制：PCR 产物酶切前尽量进行纯化，避免 PCR 产物中带入的其它物质影响酶切反应。通常建议 PCR 产物的添加量占总反应体积 25% 以下。
（5）使用错误的缓冲液：应使用我司随酶提供的缓冲液。
（6）温育时间过短：增加温育时间，但最长不建议超过 3 h。
（7）位点切割缓慢：某些酶对一些特异性的位点表现出较慢的切割速度，如 KasI、NarI。可适当增加温育时间，一般1~2 小时即可。
（8）需要两个识别位点：某些酶需要两个识别位点的存在才能有效切割，如BcgI、BpmI、FokI、NaeI、SacII、SfiI。若想使用此类酶切割单识别位点的底物，可尝试加入含识别位点的寡核苷酸。
（9）未在反应体系配制完成后充分混匀：推荐用枪头轻轻吹打 3 到 5 次或用手指轻弹管壁，之后用离心机瞬离。
（10）使用涡旋振荡器：不要涡旋混匀，剧烈振荡对酶的活性有极大的影响。
（11）甲基化阻断：从细菌分离的 DNA 可能被 Dam 或 Dcm 甲基化修饰，从真核生物分离的 DNA 可能被 CpG 甲基化修饰。因此使用限制酶进行酶切前，应查看该酶的甲基化敏感性，确定该酶能否用于目标底物的酶切。如果酶被 Dam 或 Dcm 甲基化抑制活性，将质粒在dam-/dcm- 菌株中培养，或者更换非甲基化敏感型限制酶。此外 PCR 产物不存在甲基化，通常也可以解决该问题。
（12）反应温度错误：部分酶的最佳反应温度不是 37℃，此类酶在 37℃一般活性较差，常见的有 BsmBI, 其最佳反应温度为 55℃。在 37℃仅有 10% 的活性。
（13）没有识别位点：一些经过重组等处理的 DNA，碱基易发生缺失、变化等，建议确定 DNA 序列无变化。
（14）缺乏保护碱基：通常限制酶发挥作用需要有一定的保护碱基，请于PCR 引物设计阶段注意添加。
（15）找不到酶切反应不能进行的原因：推荐对照DNA底物（有多个酶切位点的DNA底物例如λDNA），进行对比反应。如果对照DNA底物能够被切开而您的底物仍旧不能被切开，将两种DNA底物进行混合，进一步确保DNA底物中不存在能够抑制限制酶反应的物质。

原因（1）出现星号活性。解决方法：
• 使用随酶提供的推荐缓冲液；
• 酶切时间缩短至 5~15 min；
• 适当扩大反应体积（较小的反应体积容易造成甘油体积达到或超过总反应体积的 5%）；
• 不进行超长时间孵育（过夜消化极易产生星活性）；
• 减少反应中酶的含量；
• 降低甘油含量（通常不高于 5%）。
原因（2）如果胶中出现比预期更大的条带，这可能是由于酶与底物结合。解决方法：
• 降低使用的酶量；
• 在上样缓冲液中加入 SDS（0.1-0.5%）以分离与 DNA 结合的酶。
原因（3）限制酶切割不完全。解决方法：详见：酶切不完全可能的原因有哪些？有什么解决方法？
原因（4）被未知限制酶污染。解决方法：不洁净的管子等途径掺入酶切反应中，此时应更换未开封的新酶。