依靠DNA片段与线性载体末端15~25 nt同源序列配对，Mix内复合酶体系同步完成外切补平、缺口连接，无需额外酶切、去磷酸化、末端补平，直接一步重组，无多余碱基残留，真正实现“无缝”拼接；允许将一个或多个 DNA 片段插入到线性化载体的几乎任何位置，且不依赖于特定序列中限制性位点的存在，相比传统酶切连接克隆能更高效地连接更多DNA片段，一步反应克隆速度更快。

DNA Assembly Mix系列依赖于同源臂的互补配对，当片段过多时，同源臂易发生错配导致连接失败或错误连接，因此不建议一次性连接大量片段，片段较多时，可分步连接。经测试，DNA Assembly Mix Ultra适用于插入≤10个片段的连接场景，DNA Assembly Mix Mono适用于插入≤3个片段的连接场景。

应避免选择克隆位点上下游 50 bp 内有重复序列的区域。并且克隆位点上下游 20 bp区域内 GC 含量尽量在 40%~60%范围内。

一般推荐15~25 bp。当重组转化子产物>10 kb以上时，推荐按20~25 bp。

具体的操作指南详见：熬过夜的分子实验人必看！Gibson无缝克隆实操干货

摩尔比是关键！载体:插入片段 = 1:1 ~ 1:5，常用1:2。片段载体摩尔比过大时反而会降低连接效率，比例越大，降低越严重。对于单片段插入，片段:载体=20:1时连接效率约为2:1时的20%，片段越多，连接效率下降幅度越显著。可使用在线无缝克隆片段载体加入量计算表。

最小建议 50 bp 以上，过短的片段可能会被核酸外切酶完全切除掉。最大可用于全长26 kb质粒构建，片段越大，构建难度越大。

DNA Assembly Mix Ultra（EG24204）可以允许60 nt左右 ssDNA 进行同源重组。

50℃孵育5~60 min。1~2片段，推荐 5~15 min；3~5片段，推荐30 min；载体骨架＞10 kb或者插入片段＞4kb，推荐30~60 min。

主要是平衡Mix内复合酶的活性；较高温度抑制外切酶过度降解 DNA，同时适配短同源臂特异性退火；37℃会造成Mix内复合酶的效率不足，重组效率显著下降。